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O13 ROS探针在细胞中活性氧存在的条件下，被氧化生成红色荧光物质，红色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测O13产物的荧光强度就可以知道细胞内活性氧的水平。

本试剂盒中的O13 ROS探针为红色荧光的活性氧探针，具有510/610nm的最大激发/发射波长。在激发波长510nm，发射波长610nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、荧光显微镜等检测O13产物荧光强度，从而测定细胞内活性氧水平。

• 使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测或激光共聚焦显微镜直接拍照分析；
  
• 背景低，灵敏度高；
  
• 线性范围宽，使用方便。

组分	200T	400T
组份A：活性氧O13探针	200μL	200μL×2
说明书	1份	1份

保存：-20℃避光，避免反复冻融，有效期6个月。

• 荧光分光光度计或荧光酶标仪，流式细胞仪、激光共聚焦、荧光显微镜等激发波长510nm，发射波长610nm。
  
• 荧光专用黑色96孔板
  
• 离心机
  
• 移液器
  
• PBS缓冲液/HBSS（不含酚红）
  
• BCA蛋白定量试剂

• 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 荧光探针在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 本荧光探针在冬季气温较低时在室内时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
  
• 使用前，先将本品取出回温至室温（20℃以上），并对其进行简短离心使溶液集中于管底。
  
• 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
  
• 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
  
• 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
  
• 探针标记的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。
  
• 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下染色操作条件仅供参考。请根据实际样本情况调整或参考文献。
  
• 酚红对O13荧光探针的检测有轻微干扰，需尽可能避免。
  
• 以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O13探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃～37℃内调整。
  
• 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

一、探针标记
探针溶液可在新鲜无血清培养基、缓冲盐溶液中稀释到所需浓度，1000～10000倍稀释，以此染色液更换细胞培养基；也可直接向细胞孵育液体中加入探针溶液至所需浓度。
注：
① 开始实验前，使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度1000～10000倍稀释，1000～2000倍适合大多数细胞样本。
② 建议收到产品后，根据使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
③ 工作液现配现用。
依据细胞ROS含量的不同，O13探针终浓度可选择在1000～10000倍稀释的范围，孵育时间可选择10～90分钟，在37℃或室温进行避光孵育。
孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞。

• 原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
  
  • 按照1:1000～2000用无血清培养基稀释O13探针。
    注：
    ① 不能用含有血清的培养基稀释O13探针。
    ② 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。
    
  • 去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。
    
  • 加入适当体积稀释好的O13探针。
    注：
    ① 加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于6孔板的一个孔加入稀释好的O13探针工作液不少于1毫升。96孔板加入100～200μL。
    ② 也可以将细胞置于培养皿中的盖玻片上，加入合适培养基，使其爬片生长。
    
  • 在37℃细胞培养箱内避光孵育20～40分钟。
    
  • 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O13探针。
    注：
    ① 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。
    ② 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
    
  • 加入200μL HBSS缓冲液。
    注：也可以用PBS/细胞培养基。
    
  • 荧光酶标仪、荧光显微镜（含合适滤片）检测。
• 收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
  
  • 按照1:1000用无血清培养基稀释O13探针。
    注：
    ① 不能用含有血清的培养基稀释探针。
    ② 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。
    
  • 离心移除培养基，用PBS洗细胞一次。
    
  • 细胞收集后悬浮于稀释好的O13探针中，细胞浓度为1×10⁶～2×10⁷/mL，37℃细胞培养箱内避光孵育20～40分钟。每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
    
  • 用无血清细胞培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的O13探针。
    注：也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。
    
  • 用HBSS/PBS/无血清细胞培养基重悬细胞。
    
  • 用荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测。
    注：
    ① 对于悬浮细胞，也可将细胞贴附于经细胞粘合剂处理过的盖玻片上，然后使用类似于贴壁细胞的方法进行染色。
    ② 如果需要盖玻片上固定化的细胞，那么可在铺片前可以先用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）包被载玻片或盖玻片。
    ③ 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。

二、活性氧检测：

• 对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜，直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。
  
• 或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
  
• 对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以（需要有相关的荧光强度分析软件）。
  
• 使用488～535nm激发波长，590nm～610nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
  
• 荧光强度强，活性氧含量高。
  注：如果用显微镜拍照分析的话，需要细胞分布均匀。

• 活性氧结果如何分析？
  ROS是多种物质的统称，不像某一单一活性氧指标，无法检测其绝对的含量，只能通过设置参照样本，以参照样本的倍数来反映目标样本相对含量变化，这个“相对”是针对参照的。分析结果是定性的，也是没有单位的，因为它本质上是一个比值（目标/参照）。反映的是模型样本通过具体的干预措施（如养分缺失、缺氧、药物治疗或遗传基因操控等）如何影响其ROS的变化，测定其ROS是增加或者降低了。
  
• 荧光照片如何分析？
  需要有相关的荧光强度分析软件。ROS表达水平直接通过荧光信号的强弱和分布范围来体现。
  有的显微镜扫描下来的图像本身就可以测面积和强度，可以同时测不同颜色的荧光强度。有的显微镜不支持此功能，可以将荧光染色彩色图像转换为黑白的灰度图，然后再以灰度值作为测量指标进行分析。
  要结合明场的照片具体分析。如果细胞分布均匀可以算固定面积荧光强度。成像时中心和四周有差异时，一般将四周剪切掉也可以。如果细胞分布不匀，需要找到细胞分布匀称的视野，一个视野一个视野找。
  如果要用图片做结果，就要平行做多个图片，作分析，统计，每张都要求荧光分布尽量一致。
  为了去除杂光的影响，可以适当调节统计荧光的强度范围，将信号过弱的背景杂光去除掉。对照组和实验组整张图片需要做同样的处理，保证所有参数均要一致。
  对于不同情况荧光强度的统计方法，根据实验需要或参考文献。可以算等面积的平均强度；也可以算阈值高于一定值的平均强度；也可以算荧光的累积而不算平均。
  要根据课题需要选择合适的测量统计方法。
  
• 荧光照片效果不好？
  荧光拍照存在很多变量，每一个变量都会严重影响拍照效果。
  荧光拍摄条件：拍摄环境、显微镜品牌和激发荧光决定了镜下观察的效果。同样的操作方法和切片，在不同品牌显微镜下显示出完全不同的荧光强度。
  荧光衰减：荧光物质的衰减通常都是非常明显的。同样的一组切片，1小时内拍摄和8小时后拍摄，荧光效果完全不同。
  最好用激光共聚焦显微镜，激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，通常同一张片子激光共聚焦的效果明显更优。

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